TAQ POLYMERASE LÀ GÌ

  -  

Thuật ngữ PCR là viết tắt của "Polymerase-Chain-Reaction", đấy là một bội nghịch ứng nhân phiên bản DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt độ. Bài viết này nhằm mục tiêu trình làng những ban bố đặc trưng về nghệ thuật PCR cũng tương tự những vụ việc hay gặp lúc thực hiện chuyên môn này.

Bạn đang xem: Taq polymerase là gì

 

KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?

 

Thuật ngữ PCR chỉ một làm phản ứng nhân bản DNA dựa trên những chu kỳ luân hồi nhiệt. Phản ứng ra mắt trong một ống thử bé dại đựng dung dịch phản nghịch ứng (Hotline là PCR mix). Trong PCR set vẫn chứa các thành phần:

1) Polymerase chịu nóng (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ hoạt động về tối ưu sinh sống 72 oC.2) 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP.. là vật liệu để tổng phù hợp ra những phiên bản sao DNA.3) DNA chứa trình từ bỏ phương châm (Template): Đôi khi vào xét nghiệm thì đấy là DNA thu dìm từ chủng loại cần xét nghiệm.4) Cặp mồi sệt hiệu (Primer): Đây là những đoạn oligo-nucleotide nhiều năm khoảng tầm 20 nucleotide cùng bắt cặp bổ sung cập nhật sệt hiệu đến 2 đầu trình từ bỏ kim chỉ nam đề nghị nhân bạn dạng.5) Cation Mg2+ (MgCl2): đấy là co-factor quan trọng nhằm Taq polymerase chuyển động kết quả.6) Dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer): Cung cấp môi trường dễ dàng mang lại phản ứng nhân bạn dạng diễn ra.

 

Ống nghiệm cất PCR mix sẽ được đặt vào vào buồng ủ của máy luân nhiệt (Thermo cycler), sinh sống toàn nước thì thường xuyên call luôn là đồ vật PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của sản phẩm PCR vẫn thay đổi theo chu kỳ luân hồi, nhờ vào này mà quá trình nhân phiên bản DNA được diễn ra (coi video).

 

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR

 

Một chu kỳ nhiệt độ của PCR đã gồm 3 giai đoạn nhiệt độ (Hình 1):

1 - Giai đoạn phát triển thành tính: Nhiệt độ sẽ được gửi lên 94 oC, các liên kết hydro có khả năng sẽ bị phá đổ vỡ khiến DNA bị biến hóa tính thay đổi dạng mạch 1-1.

Xem thêm: Mùa Đông Có Hoa Gì Đặc Trưng? Loài Hoa Gì Nở Đẹp Nhất? Những Loài Hoa Đặc Trưng Mùa Đông Hà Nội

2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, các đoạn mồi đã bắt cặp bổ sung cập nhật vào 2 đầu trình tự mục tiêu.3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTPhường để kéo dãn dài đầu 3" của mồi và tạo thành mạch bổ sung.
*
Hình 1. Chu trình sức nóng của một quá trình PCR

Bởi vậy, cđọng qua một chu kỳ nhiệt độ, số mạch DNA sẽ tiến hành nhân song. Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại thường xuyên 30 - 40 lần thì số phiên bản sao đang là 230 ~ 240 bản sao. Số lượng phiên bản sao DNA đẩy đà này lúc được đính các phân tử vạc bộc lộ (ví dụ Ethidium Bromide) có thể nhận thấy bởi đôi mắt hay trên gel năng lượng điện di dưới ánh đèn sáng UV (Hình 2).


1527453158292/Agarose-gel-electrophoresis-analysis-stained-with-ethidium-bromide-of-PCR-products.png" alt="*">
Hình 2. Hình ảnh chụp thành phầm PCR (giếng 1~7) dưới ánh đèn UVtrên gel agarose nhuộm bởi Ethidium Bromide

 

VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR

 

Nguyên ổn lý của PCR là khuếch tán DNA, vị vậy những chống phân tích áp dụng PCR thường xuyên ko nhanh chóng thì muộn cũng trở thành bị lây truyền thành phầm PCR lên toàn bộ các vật dụng, hình thức, hóa chất. Người có tác dụng thí nghiệm vẫn phân biệt được thảm thảm kịch này lúc toàn thể các lần chạy PCR hầu hết ra dương tính, kể cả lúc áp dụng chủng loại là nước cất. Khi điều này xẩy ra thì chỉ có bí quyết quăng quật toàn thể hóa chất, khử truyền nhiễm toàn thể phòng xem sét .... Dù thế vấn đề này vẫn đã tái diễn sau một khoảng chừng thời hạn sử dụng PCR.


*
Hình 3. Sơ đồ gia dụng cách xử trí sản phẩm PCR nước ngoài lây lan bởi UNG

Nhiễm thành phầm PCR từng là thử thách so với các chống thí điểm sinh học phân tử. Tuy nhiên, hiện nay các bên khoa học sẽ có thể xử lý sự việc này một cách hơi hữu ích (Hình 3), sẽ là vào yếu tắc dNTP có bổ sung thêm 1 ít dUTP.. Các thành phầm PCR tạo nên đã luôn mãi mãi một vài vị trí là U ráng vì chưng T, những địa chỉ U này đang hoàn toàn có thể cách xử lý phân hủy bằng enzme UNG. Mẫu DNA thu dấn từ bỏ chủng loại thật (template) sẽ không còn chứa U, vì chưng vậy ủ PCR phối cùng với enzyme UNG trước lúc PCR để giúp phân giảm toàn thể các DNA ngoại truyền nhiễm nhưng ko ảnh hưởng cho template.

 

CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶPhường TRONG XÉT NGHIỆM

 

1) PCR đối kháng mồi (Simplex PCR): Đây là thứ hạng PCR cổ xưa nhất, thực hiện 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch tán 1 đoạn trình từ kim chỉ nam độc nhất.

2) PCR nhiều mồi (Multiplex PCR): Đây là hình dạng PCR thực hiện nhiều cặp mồi khác nhau nhằm khuếch đại những trình trường đoản cú mục tiêu không giống nhau trong thuộc 1 phối làm phản ứng. Để xây dựng được phản ứng Multiplex PCR yên cầu các cặp mồi sử dụng buộc phải gồm thuộc ánh nắng mặt trời bắt cặp và những cặp mồi này cũng không được bắt cặp với nhau tuyệt bắt cặp chéo cho nhau. Bên cạnh đó, cũng bắt buộc đảm bảo an toàn độ nhạy Multiplex PCR tương đương cùng với Simplex PCR, vấn đề đó rất cạnh tranh xẩy ra yêu cầu thông thường multiplex PCR được áp dụng sống những tế bào nuôi cấy do từ bây giờ con số trình trường đoản cú đích đầy đủ to sẽ không đòi hỏi quá nghiêm ngặt về độ nhạy cảm.

Xem thêm: Hướng Dẫn Cách Cài Game Cho Iphone Và Ipad, 2 Cách Tải Game Android Cho Ios Đơn Giản Nhất


*
Hình 4. Sơ đồ một quy trình Nested PCR

3) PCR tổ (Nested PCR): Sử dụng 2 cặp mồi, cặp mồi phía bên ngoài (outer primer) với cặp mồi bên phía trong (nested primer). Cặp mồi bên phía ngoài đã tyêu thích gia PCR lần 1 trước để làm tăng số lượng DNA cất trình tự đích, tiếp theo là cặp mồi phía bên trong đang tmê say gia PCR lần 2 nhằm phạt hiện tại trình trường đoản cú đích (Hình 4). Kỹ thuật này sử dụng khi cặp mồi đặc hiệu mang lại trình từ bỏ đích (nested primer) gồm độ nhạy kém.

4) RT-PCR: Là tiến trình áp dụng khi trình trường đoản cú đích là RNA, hôm nay đề nghị một bước sử dụng enzyme reverse transcriptase để gửi RNA thành cDNA trước lúc PCR, quy trình tiến độ này Hotline là tiến độ RT. Kỹ thuật RT-PCR gồm 2 một số loại (Hình 5):